Усули тадқиқот генетикӣ молекулавӣ

Ба таҳқиқ ва муайян кардани вариантњои дар усули сохтори ДНК истифода молекулӣ генетикии. Барои ҳар як минтақа ДНК, ки дар ин минтақа омӯхта аз chromosome, генофонди ё allele, усулҳои фарқ мекунанд. Аслї ва кадом усули генетикии молекулавӣ иборат баъзе ё сӯистеъмоли дигар RNA ва КДН. Ҳамаи ин усул аз тарафи як мураккабии бузурги хос, бидуни шароити лабораторӣ берун карда намешавад гузаронида, ва кормандони бояд баландихтисос бошад. Ин кор аст, ки дар чанд марҳила сурат мегирад.

марҳилаҳои

Якум, намунаҳои RNA ё ДНК ба истеҳсол карда мешавад. Дар ин ҷо, усули генетикӣ молекулавӣ метавонад ба қариб ягон мавод истифода бурда мешавад: нутфае хун, leukocytes, fibroblasts фарҳанг, mucosa (scraped), ҳатто мӯй фолликулҳо, аз - ДНК мумкин аст аз ҳар гуна намуна ба даст. Мавод барои истифодаи ҳама гуна методҳои генетикии молекулӣ ва имконоти гуногуни аст ва ин ДНК дароз ҷудо яхкардашуда нигоҳ дошта мешавад. Дар марњилаи дуюм аст, ки ба ҷамъшавии пораҳои дилхоҳро (amplification) КДН бахшида, мисли он кӯмак мекунад, таъмини вокуниши занҷираи polymerase дар vitro (дар vitro бе иштироки зиндагӣ организм). Дар натиҷа, интихоб қитъае ДНК подоши ин силсилаи реаксия, ва ба маблағи айнан миллионҳо маротиба КДН меафзояд.

Дар қадами сеюм дар усулҳои тадқиқоти генетикӣ молекулӣ назар аст, маҳдуд меафзуданд (ба ин тика ларза андоҳта, ё буридани). Мањдудияти дар polyacrylamide ё gel agarose аз тарафи electrophoresis. Ин усул молекулӣ-генетикии омӯзиши қитъае ДНК, ки имкон медиҳад, ҳама ба гирифтани як мавқеи муайян дар gel. Баъд аз ин, gel аст, ки бо бромид ethidium муносибат, қодир ҳатмӣ ба КДН, ки шуоъзании бо нури ултрабунафш, он гоҳ ба он имконпазир аст, ки ба риоя қисмҳои luminescence. усулҳои ташхис генетикӣ молекулавии гуногуну сершумори, вале ду қадамҳои аввалин умумӣ ба ҳама мебошанд. Аммо, бо маќсади муайян намудани оҳанпора ДНК, ки gel мумкин ранг, ва бисёр дигар усулҳои мавҷуда.

намуди

Усулҳои бевосита бештар ва густурда барои ошкор mycobacteria метавонад аз инҳо иборат усули таълими ДНК генетикӣ молекулӣ боло. моҳияти он аст, ки, ба хотири муайян кардани маводи занҷираи скан пораҳои мушаххаси ДНК беморзо. техникаи ташхисӣ генетикӣ молекулӣ ҳанӯз ба таври бештар самаранок эътироф чунин бемориҳои сил надоранд. Бо истифода аз вокуниши занҷираи polymerase (ЗМФ), шумо боварӣ дошта метавонем, ки ДНК аслии шумораи нусха ба як миллион баробар зиёд, яъне, он ҷо хоҳад amplification, ва он ба натиҷаҳои нишон медиҳад. зиёда аз наваду панҷ фоиз, аст, ки Бартарии асосии ин усул - Сатҳи ҳассосияти хеле баланд аст.

Қисми боқимондаи усулҳои молекулӣ-генетикӣ таҳқиқоти илмӣ оид ба самаранокии ҳосили қоидаи айнан баробар, зеро дар ин ҳолат намуна таҳия нишон пайдарпаии oligonucleotide мушаххас ба як саду шаш баробар зиёд гардид. Ҳатто ташхиси фарҳанги сил системаи нафаскашї ба таври назаррас ҳассосияти он паст. Ин аст, ки чаро тибби муосир ба усулҳои генетикии молекулӣ ташхиси бемории сил асос ёфтааст. A усули тасвир самаранок мебошад, хусусан дар муносибат бо микроорганизмҳои таѓйирёбанда antigenic баланд, муайян, ки роҳи дигар аст, хеле мушкил бештар - талаб махсуси ВАО ғизоӣ ва инкишоф муддати дароз. усулҳои генетикии биохимиявї ва молекулавӣ истеҳсоли ин таъсири хеле гуногун оид ба натиљањои.

Ташхис бемории сил

ташхис Маршалл ЗМФ сил одатан бештар бо истифода аз касоне, Пасиҳамоии ДНК, ки махсус барои ҳамаи чор намуди беморї мебошанд. Барои ноил шудан ба ин ҳадаф бисёр истифода Primers, ки ба ошкор сохтани пайдарпаии АСТ унсурҳои (АСТ-986, АСТ-6110), ки ин унсурҳо тавсиф намудҳои хеле муҳоҷиратии сил Mycobacterium ва ҳамеша қоидаи мазкур дар genome. Ҳамчунин истихроҷи ДНК мумкин аст аз фарҳангҳои пок ва клиникии (балѓами беморони) бо усули муносиб ва дигар анҷом дода мешавад. Масалан, усули Ривоҷ он ҷо, ки буферӣ lysis аст, дар асоси thiocyanate guanidine ва silica чун ДНК интиқолдиҳанда истифода бурда мешавад. Шумораи беморони, ки ба фарқ бактериологӣ камбизоат зиёд ҳар сол, ва аз ин рӯ дар амал клиникии сатҳи комилан гуногуни ташкилот таъсис дода шудааст: усули молекулӣ-генетикии ДНК аз таҳсил кардааст нақши асосӣ дар ташхис.

Бо вуҷуди ин, мо бояд иқрор шуд, ки дар он аст, ки бе норасоиҳои нест. Усули ЗМФ аст, истифода аз вақт меорад, ки шумораи зиёди натиҷаҳои бардурӯғ-мусбат, ва сабаби на танҳо хатогиҳо техникї, инчунин хусусиятҳои усули худ аст. Илова бар ин, бо истифода аз ин усули ташхис ба муайян намудани қобили mycobacteria, ки муайян шудааст, ин аст, танҳо ғайриимкон аст. Аммо ин амсолони аст, аз ҳама муҳим аст. усулҳои генетикии молекулавӣ ташхис ЗМФ боиси хатари ифлосшавии КДН mycobacterial. талаботи сертификатсия ба ин сабаб, ки барои лабораторияҳои ЗМФ тарҳрезӣ танҳо сахт, ки онҳо талаб се бинои алоҳида. технологияи ЗМФ замонавӣ ва хеле мураккаб аст, аз он талаб мекунад, ки истифодаи таҷҳизоти мувофиқ ва кормандони баландпояи таълим дода шаванд.

bacterioscopy

Вақте, ки натиҷаҳои ташхиси таҳлил бояд бо маълумоти дигар дар муқоиса карда мешавад: муоинаи клиникии, radiography, microscopy мусбӣ, зироат ва ҳам вокуниш ба табобати махсус хеле муҳим аст. Дар ин силсила, таҳқиқоти ЗМФ аст, танҳо яке аз ҷузъҳои. Ошкор кардани pathogen дар аввали ташхис метавонад соддатарин ва тези усулҳои - бактериологӣ.

аст, истифода бурда микроскоп сабук (ранги Ziehl-Neelsen) ва хурди (ранги fluorochromes) нест. Бартарии суръати мусбӣ натиҷаҳои аст. Аммо аыидаи он дуруст ҳисоб иќтидори мањдуди сабаби ҳассосияти паст. Вале, ин усули тавсияи ТУТ ҳамчун иқтисодӣ бештар ва замин ошкор беморони сил дода мешавад. Дарёфт усули бактериологӣ mycobacteria дорад, арзиши пешг ва тахминан ихрољи миқдоран бактериявї. Хеле боварии бештар барои мубориза бо он усулњои молекулӣ тадқиқоти генетикии бемории сил.

фарҳангҳо

ошкор Бењтар намудани mycobacteria таҳқиқоти фарҳангӣ эътироф мекунанд. Кишти маводи эътилолї аз он аст, ба миёна тухм дод: Mordovsky, Фин II, LJ, ва ба инҳо монанд. Маҳакҳои кори муқовимати mycobacteria ба доруворї ва далели ғайримустақими самаранокии як қатор mycobacteria ва колонияҳои онҳо дар vitro, агар ба усули истифода аз фарҳанги илмӣ. Барои баланд бардоштани фоизи бунбасти inoculation mycobacteria маводи эътилолї аст, дар муҳитҳои гуногун баргузор мегардад.

Мулоқоти талаботи сершумори фарҳангӣ, аз ҷумла pathogen грант ва моеъҳои. Истифода бурда мешавад, ки дар ин система ва автоматишудаи навъи бањисобгирии афзоиши VANTES. Зироат бояд дар исоб мӯҳлати то ҳафт то ҳашт ҳафта баргузор мешавад. То ин вақт зироат бо набудани рушди метавон баррасӣ манфӣ. ташхис маводи беморињои хукон Гвинея, ки ба сил хеле халалҳо мебошанд: Дар роҳи аз ҳама самаранок барои ошкор сил Mycobacterium намунаҳои биологӣ дида мебароем.

Баъзе рақамҳо

сирояти нињонї - соҳаи ҷолиб таҳсил, ки аз тарафи ташхиси ЗМФ кушода шуд омӯзиши M. сил буд. Консепсияи муосири сирояти бемории сил пешниҳод менамояд, ки аз сад нафар, ки дар тамос бо М. сил буданд, наваду метавонад, инчунин мубталои шавад, вале танҳо даҳ онҳо бемории фаъол аст, таҳия шуда истодааст. Дигарон бошанд, онҳо нерӯмандтаранд сил, зеро навад фоизи њолатњои сирояти нињонї боқӣ мемонад. Ошкор намудани як намунаи он усули генетикӣ молекулӣ кӯмак.

Генетика мегӯянд, ки панҷоҳу панҷ дарсади касоне, ки зироатҳои эътилолї маводи манфӣ буданд, ва ҳаштод фоиз одамоне, ки мубталои бемории сил М., балки равон бо нест зуҳуроти radiographic беморї, посухҳои ЗМФ мусбат ба ҳузур пазируфт. Ин усули ташхисӣ генетикӣ кӯмак кард, ки муайян намудани беморон дар хатар, ки бо тадқиқотҳои ЗМФ, бо натиҷаҳои тањлилњои худро (microscopy ва фарҳанг) аст шуданд манфӣ, ва сирояти subclinical М. сил мазкур буд.

тадқиқоти муосир

Дар Федератсияи Русия ва озмоишгоҳҳои бактериологӣ истифода усули зудамалкунанда консентратсияи мутлаќ: фаъолияти reductase нитрат аз mycobacteria озмоиш аз ҷониби reagent Griess. марказњои мубориза бо сил истифода усули, ки имкон медиҳад, ки муайян кардани муқовимати маводи мухаддир. Ин кишти такрорӣ дар ВАО моеъ, ки дар он автоматӣ радиометрикї ва системаи бањисобгирии хурди афзоиши mycobacteria. ба ду ҳафта то - Чунин таҳлил аст, зуд анҷом дода мешавад.

Айни замон, усулҳои нав ташаккул меёбад: муқовимати маводи мухаддир mycobacteria аст, ки дар сатҳи genotype ба андоза пур кардаанд. Омӯзиши механизмҳои молекулӣ аз genes муқовимат ва ҳузури дар mycobacteria нишон медиҳад. Ин genes бо муқовимат ба доштани нашъаҳои муайян ва алоқаманд аст. Барои мисол, genes kasA, Инха, katG тобовар ба isoniazid, генофонди rpoB - genes RNA 16Sp rifampicin ва rpsL - streptomycin, emb1 - ба ethambutol, gyrA - як fluoroquinolone ва ғайра.

мутатсия

Дар ташхиси муосир барои омӯзиши ДНК ба таври назаррас афзоиш усули сатҳи молекулӣ-ирсї ва иҷозат барои гузаронидани таҳқиқоти-миқёси калон аз мутатсия дар тамоми спектри кунанд. Акнун мо медонем, ки мутатсия бештар маъмул дар 516, 526 ва 531 codons генофонди rpoB, ва дар муқовимат ба маводи мухаддир гуногун муайян карда мешавад. аст, як қатор усулҳои барои матнро аз mycobacteria истифода на танҳо усулҳои анъанавӣ нест - биохимиявї, биологӣ ва фарҳангӣ, балки низ васеъ истифода бурда техникаи генетикии молекулӣ муосир. Аллакай муносиб нест ва таъмини усули ташхиси дуруст барои ошкор намудани бемориҳои monogenic. Онҳо дар бораи таҳқиқоти ДНК дар соҳаи аниқи як генофонди махсус асос ёфтааст. Ин аст, ки одатан як раванди мураккаб, замонӣ ва гарон, вале маълумоти, ки аз тарафи таҳлили генетикӣ молекулавӣ таъмин аст, хеле бештар дақиқ ва иттилоотӣ аз маълумоти ҳамаи таҳлилҳои дигар.

Он қадар маълум шуд, ки ДНК тавр барои тамоми ҳаёти организм, ки ба он дар ҳама гуна odnakova ҳуҷайраҳои nucleated аст, дигаргун накунад, ва ин имкон медиҳад, ба таҳлили тамоман ҳуҷайраҳои бадан, дар ҳар марҳилаи ontogeny. Дар генофонди зарар метавонад пеш аз пайдоиши нишонаҳои аввал ба бемории клиникӣ-миқёси пурра, инчунин дар одамони солим heterozygous ошкор, лекин як mutation дар генофонди. усулҳои ташхис бемории авлод ирсї молекулӣ имкон ошкор он (равиши мустаќим, ДНК-ташхис), инчунин барои тањлили сегрегатсия бемории дар оила бо ДНК marker мавзеъ (polymorphisms генетикии), ки бо як генофонди зарар (яъне, муносибати бавоситаи КДН-ташхис) алоќаманд мебошад. Бевосита ё бавосита - ҳама гуна ташхиси ДНК дар асоси усулҳои муайян намудани як қисми қатъӣ муайян ДНК инсон асос ёфтааст.

усули бевосита

усулҳои мустақим ташхиси ДНК, вақте бемории насибаи генофонди гунаҳкор маълум аст, инчунин маълум, ва навъҳои мутатсия он. Масалан, усули бевосита муносиб дар як қатор бемориҳои. Ин chorea Хантингтон кард (тамдиди CTG-бозмегардонад), phenylketonuria (R408W), fibrosis cystic (delF508, мутатсия калон) ва ба инҳо монанд. Бартарии асосии усули бевосита ба дурустии ташхисӣ сацмиядорон моликияти аст, ва зарур нест, ба кор таҳлили ДНК боқимондаи оила вуҷуд дорад. Агар mutation дар генофонди дахлдор ёфта, он имкон медиҳад, маҳз тасдиќ ташхис мерос, муайян genotype барои дигарон оила дӯши худ гирифтааст.

Боз як ташхиси бевоситаи бартарии дониста муайян интиқолдиҳанда heterozygous аз мутатсия бад аз хешовандон ва падару модар, ки аз бемории ба ҳалокат расидааст. Ин аст, махсусан ҳақиқӣ барои бемориҳои autosomal recessive. Камбудиҳои усули бевоситаи низ дастрас мебошанд. Ба кор бурдани онҳо, ба шумо лозим аст, ки бидонед, маҳз мањдуд кардани генофонди ғайримуқаррарӣ, сохтори exon-intron спектри ва мутатсия он. На ҳамаи бемориҳои monogenic имрӯз чунин маълумот гирифтанд. усули бевоситаи Informativeness нест, баррасї пурра, зеро ки як ва генофонди ҳамон шояд теъдоди зиёди mutation эътилолї, ки боиси рушди бемориҳои ба кўча доранд.

усулњои ѓайримустаќими

усулҳои ғайримустақим дар ташхиси ДНК доранд, дар ҳамаи, истифода бурда мешавад, дар дигар ҳолатҳое, ки агар генофонди зарар муайян нест, балки танҳо chromosomally ё агар ташхиси хатти кард, дар натиҷа ноумед намешавем (аз он рӯй медиҳад, ки агар генофонди ташкилот молекулавӣ мураккаб ё ба андозаи калон, агар як ҷо мутатсия эътилолї). усулҳои ғайримустақим таҳлили сегрегатсия аз нишонгузорҳо polymorphic дар оилаи allelic анҷом дода мешавад. Нишонгузорҳо дид, ки дар минтақа chromosomal якхела ё locus зич ба бемории алоќаманд ва намояндагӣ ҳазфҳо ва ё insertions, substitutions нуқтаи, онҳоро бозмегардонад ва polymorphism аст бо сабаби ба миқдори гуногуни ҳуҷайраҳои дар блоки.

Аксари қулай барои ташхис microsatellite баррасӣ ва minisatellite polymorphisms ғайримустақим, ки ба таври васеъ дар genome инсон тақсим карда мешавад. арзиши худро баён дар мазмуни маълумот баланд, ки агар зарари ба масофаи генетикии байни marker ва генофонди аст, хеле калон аст. Дар ин ҳолат, дуруст баҳо аст, ба қадри кофӣ муайян басомади навшудаи байни marker polymorphic ва зарар. усулҳои ташхис ѓайримустаќим низ қадами пешакии њатмии басомадњо allele аз омӯзиши аҳолӣ таҳлил байни беморон ва интиќол мутатсия, ҷамъи зарурати муайян намудани эњтимолияти навшудаи nonequilibrium ва пайвастан нишонгузорҳо ва alleles Мутанти таъмин намояд.

усулҳои дигар

гурўњњои мухтасари RNA ё ДНК, инчунин генофонди ягона visualized зери омӯзиши микроскопї мумкин нест, бинобар ин, барои муайян намудани мутатсия лозим тарафи ташхиси генетикӣ молекулӣ. аст, "Лоиҳаи Genome инсон», инчунин пешрафти дигар генетика молекулӣ ҷо хеле васеъ имконияти ташхис бемориҳои ба кўча - ҳам томактабї ва постнаталї. Ин усул метавонад ошкор аввали таъмин ва як poly- пешг ва бемориҳои monogenic, ки debut сурат мегирад камол. Мутаассифона, бо сабаби ба имкониятҳои техникии таҳқиқоти генетикӣ молекулавӣ баъзан берун аз ҳудуди ахлоќї, ки дар робита ба мерос гузошт, махсусан вақте ки ташхис дар наврасӣ ва кўдакон мебошад.

нуќсонњо chromosomal сохторї ва ададӣ сабабњои бештар аз беморӣ ва саратон, ва бисёр malformations мебошанд. aberrations Chromosomal бояд муайян карда шавад, ки барои машварати оила муҳим аст - барои арзёбии дурнамои, дар якҷоягӣ бо хатари репродуктивї, ҳомиладории оянда. Таҳлили Chromosome «стандарти тиллоӣ» -и ташхиси генетикии аст, вале он маҳдуд аст. Танҳо усулҳои таҳлили генетикӣ молекулавӣ корҳои бештареро метавонанд, чунки истифода cloning технологияи асоси тамғакоғазҳо хурди қодир ҳассосияти баланди онҳо барои муайян намудани тағйирот chromosomal нозук, ки ғайриимкон аст барои ошкор классикӣ вуҷуд омӯзиши cytogenetic. Ин техникаи ҳарчи бештар васеъ имкониятҳои ташхис мо, вақте ки тафтиш, кӯдакони маъюб, акидахо, бо бисёр дигар бемориҳои ба кўча.

натиҷаҳои

Ин барои инсоният хеле муњим сохтори генофонди ва вазифаи дониш, намудҳои таѓйирёбанда, қобилияти ошкор бемориҳои ба кўча, ки дар робита бо рушди генетика молекулавӣ рух буданд аст. усулҳои он доранд, дар омӯзиши молекулаи ДНК равона - ва муқаррарӣ, вақте ки аз он аст, ва ҳангоме ки аз он зарар аст. Тайёр намудани Пасиҳамоии кислотаи ДНК аз nucleotides (ДНК) меафканад дар марҳилаҳои аз қабули намунаҳои муайян пораҳои инфиродӣ. Хусусияти хоси КДН genomic аз ҳуҷайраҳои, маҳдудияти (нахӯрӣ), amplification (cloning), electrophoresis аз пораҳои (ҷудо масъул барқ ва вазни молекулавии аз тарафи gel agarose). Муайян намудани пораҳои мушаххас ҷойгир шудааст бар рӯи як рахи гусаста.

Сипас даст ба амали филтрҳо махсус, ки ба воситаи он мегузарад ҳар hybridization қитъае бо пораҳои ДНК cloned ё probes радиоактивӣ синтетикӣ назорати, ки барои ҳар як намуна озмоиши баробар бошад. Агар шумо ба вазифа ё дарозии муқоиса бо таҳқиқи тағйир, агар ки қитъае нав ва ё нопадид - ҳамаи ин нишон медиҳад, ки ба генофонди таҳлил паси кардааст таҷдиди дар пайдарпаии nucleotide аст. ҳашт техникаи асосии таҳқиқоти генетикӣ молекулавӣ вуҷуд дорад: мураттабии (муайян намудани пайдарпаии ДНК), вокуниши занҷири polymerase (афзоиши шумораи Пасиҳамоии), тайёр намудани Primers маълум genes, cloning ДНК, истеҳсоли молекулаҳои recombinant даст сафедањо сабаби молекулаҳои recombinant, ташкили маҷмӯи пурраи фирмавии (дар ҷамъоварии китобхона) пораҳои, ки аз тарафи истифодаи маҳдуд ба даст оварда буданд, cloned.